細胞凍存液操作步驟

（一）細胞凍存

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液，取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用PBS清洗，去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養皿表面）把單層生長的細胞消化下來， 離心1000rpm，5min；

2.去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的zui終密度為5×106/ml～1×107/ml，將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

3.在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者，凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

（二） 細胞復蘇

1.從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化，從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻；

2.離心， 1000rpm，5min；棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；

3.次日更換一次培養液，繼續培養。

注意事項

1．從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但為對數生長期細胞。在凍存前一天換一次培養液；

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；

3．凍存和復蘇用新配制的培養液。

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