1.什么是化學成分明確的無血清培養(yǎng)基?
答:化學成分明確的培養(yǎng)基只含有分子量和濃度已知的組分。
2.使用無血清培養(yǎng)基或組分有什么優(yōu)點?
答:批間一致;化學成分明確;與含血清培養(yǎng)基相比,蛋白產(chǎn)量高、細胞死亡率低、細胞活性高;培養(yǎng)基性能穩(wěn)定,后續(xù)分離純化容易,因此無需預先篩選血清批次,簡化了生產(chǎn)規(guī)程。
3.我能用DMEM替代DMEM/F12么?
答:DMEM/F12培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基的1:1混合物,因此DMEM/F12的營養(yǎng)好于DMEM。
4.如何提高有血清培養(yǎng)的細胞向無血清培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)化的成活率?
答:一般而言,將細胞從血清培養(yǎng)條件過渡到無血清培養(yǎng)需要一個過渡,可以先嘗試梯度減少原培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)基,直到zui后*替換為無血清培養(yǎng)基即可。不要突然全部換掉原培養(yǎng)基,細胞可能會由于環(huán)境的突然改變不適應而減緩增殖或出現(xiàn)大量分化。
5.如何判斷細胞合適的傳代時間?
答:一般來說,在電鏡下觀察細胞長滿孔板(或者培養(yǎng)板/瓶)的85-90%為*傳代時間點。但具體的傳代時間也因具體實驗的要求、所需細胞的數(shù)量而有所調(diào)整。但如果細胞長不滿50%就傳代的話,也會影響細胞自身的增殖和生長(細胞與細胞之間也存在著“扎堆抱團”效應)。
6.培養(yǎng)MSCs是否需要提前鋪板?
答:針對不同的培養(yǎng)基要求不同,有一些培養(yǎng)板需要提前鋪板包被才可以使用有的不需要對使用的培養(yǎng)板進行鋪板包被處理,MSCs可以直接進行培養(yǎng)或傳代等,大大節(jié)省了鋪板膠的成本和人力成本。
7.日常培養(yǎng)MSCs的過程中,是否需要每天換液?
答:細胞培養(yǎng)換液時間應該根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求一同確定。一般2-3d應該換一次生長液。傳代操作的第二天換液,及時給新傳代的細胞補充營養(yǎng)成分,更有利于細胞的生長。
8.如何判斷培養(yǎng)的細胞是否污染?
答:細胞污染的話,從表象來看,培養(yǎng)基會發(fā)黃渾濁,如果還可以用肉眼看到一層細沙狀的污染物沉積在培養(yǎng)液底部,則是典型的細菌污染,在電鏡下還可以看到黑點狀的細菌在不斷晃動;如果肉眼看見的是白色的絲狀或者類似絮狀的物質(zhì),在電鏡下也可觀察到類似現(xiàn)象,則可判定為真菌污染。但具體是哪一類的細菌或者真菌污染,還需要更進一步的分析研究。
9.細胞培養(yǎng)基里添加抗生素是不是必須的?
答:抗生素的作用主要是防止細胞培養(yǎng)液中添加成分或者細胞培養(yǎng)操作過程中帶來的外界污染,加入抗生素可以有效降低細胞污染的幾率,但視培養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境的差異而定,抗生素也不是必須添加的。
10.細胞復蘇的原則:快速融化。必須將凍存在-80°C液氮中的細胞快速融化至37°C,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶,對細胞造成損害。
11.細胞倍增數(shù)(PD)和“傳代”之間的區(qū)別是什么?
答:細胞倍增數(shù)(PD)是在體外培養(yǎng)過程中細胞總數(shù)的2倍增加。在某個特定的時間點進行細胞倍增數(shù)的計算能夠給出一個準確的細胞年齡。相比之下,傳代僅僅是指子代培養(yǎng)過程,即從培養(yǎng)容器分離細胞(使用胰蛋白酶/EDTA或accutase),然后以較低的密度接種,以便作進一步的細胞生長。傳代通常不考慮可應用的不同的分裂比率。不同的分裂比率產(chǎn)生一個*的傳代數(shù)量,但細胞倍增數(shù)是變化的。因此,傳代只是對實際培養(yǎng)年齡的一個粗略估計。
12.培養(yǎng)正常人體細胞可以添加抗生素么?
答:為了使細胞實現(xiàn)*的生長,我們建議不要使用抗生素。在添加抗生素的情況下,大多數(shù)原代的或者正常的人體細胞的生長活性都會降低。在某些情況下,當不能保證100%的無菌環(huán)境時,為了防止?jié)撛诘奈⑸锔腥荆ㄗh在培養(yǎng)基中添加抗生素。
13.凍存的細胞和增殖中的細胞之間的區(qū)別是什么?
答:一般運送細胞需要用干冰進行保存,運輸?shù)诌_后,必須轉(zhuǎn)移到液氮中保存,或者解凍后直接接種到合適的培養(yǎng)基中,并使用合適的組織培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。
14.添加補充劑之后培養(yǎng)基可以使用多久?
答:一旦已經(jīng)向基礎培養(yǎng)基中加入補充劑,則在4°C的保質(zhì)期為6-8周。盡量避免將培養(yǎng)基重復加熱至37°C,這將降低生長因子的活性和L-谷氨酰胺的濃度。